NMJ - návod

Výukový program NMJ (neuromuscular junction - nervosvalové spojení) - návod

V této fázi praktických cvičeni bude využívána pouze část programu týkající se přímo elektrického dráždění svalu.

Po spuštění programu se na obrazovce objeví základní obrázek s požadavkem: „Please enter your name". Napište svá jméno a stiskněte tlačítko „Enter". Panel s výzvou zmizí a Vaše jméno se objeví v horním řádku tabulky v levé dolní části obrazovky.

Nejprve se seznámíme s celkovým uspořádáním pokusu. V horní liště vybereme položku Help a v rozbalené nabídce zmáčkneme tlačítko Preparation. Objeví se následující schéma uspořádání pokusu:

Z anestetizovaného potkana byla vypreparována část bránice s příslušným frenickým nervem a umístěna do ploché misky, kterou pomalu protéká Krebsův roztok nasycený směsí 95% O₂ a 5 % CO₂ o teplotě 32 °C. Do tekoucího Krebsova roztoku mohou být přidávána různá farmaka a rovněž jeho iontové složení může být měněno. Miska je umístěna na stolku preparačního mikroskopu a do oblasti nervosvalové ploténky je zavedena skleněná mikroelektroda s hrotem menším než 0,1 µm. Svalové vlákno může být aktivováno buďto trans-synapticky při podráždění nervu, čemuž prozatím nebudeme věnovat pozornost, nebo přímo injekcí depolarizačního proudu o nastavitelné intenzitě a trvání (viz dále).

Po seznámení se s uspořádánim pokusu stiskneme tlačítko „Continue", načež, schéma zmizí a objeví se základní display s obrazovkou osciloskopu vlevo a „clipboardem" pro uschování důležitých záznamů vpravo. Na „stínítku osciloskopu" se zobrazuje membránový potenciál svalového vlákna snímaný mikroelektrodou zavedenou do oblasti nervosvalové ploténky. Časová základna oscilogramu je asi 16 ms a je spouštěna těsně (asi 1 ms) před okamžikem stimulace.

Stimulace svalu:

Stimulate (v horní liště)

Muscle (v rozbalené nabídce)

Pomoci číselných kláves můžeme libovolně měnit jak velikost stimulu (Amplitude), tak jeho trvání (Duration).

Po stisknuti rámečku Stimulate započne animace membránového potenciálu na osciloskopu. První milisekundu je zobrazen klidový membránový potenciál, potom začne stimulace podle námi zadaných parametrů (intenzita a trvání). Po uplynuti 16 ms je záznam ukončen.

Kopírování na clipboard:

Clipboard (v horní liště)

Copy to Clipboard (v rozbalené nabídce)

Pokynem Clear Clipboard můžeme zkopírované záznamy vymazat.

Clipboard se použije ke srovnání tvarů akčniho potenciálu po různých zásazich.

Změna iontové koncentrace:

Ions

Vybereme příslučný iont (v rozbalené nabídce), zadáme požadovanou koncentraci a potvrdíme tlačítkem OK. Aktuálně nastavená koncentrace iontů se objeví v rámečku v levém dolním rohu obrazovky. K výchozí fyziologické koncentraci všech iontů se vrátíme tlačítkem "Reset to normal", které najdeme jako poslední položku v rozbalené nabídce ikony Ions v horní liště.

Podáváni farmak:

Drugs (v horní liště)

Objevi se tabulka Add Drug. Podání látky se děje jejím zvolením v nabídce a zadáním požadované koncentrace. V tomto cvičení bude použit tetrodotoxin a 3,4-diaminopyridin. Koncentrace přidaného farmaka se zobrazí v rámečku vlevo dole pod údaji o iontovém složení promývacího média. Po skončení pokusu s přidáváním farmak nezapomeňte vrátit čistý promývací roztok stisknutím tlačítka Clear All Drugs.

Hodnocení změn akčního potenciálu:

1. Klidový membránový potenciál.
2. Amplituda.
3. Rychlost depolarizace a rychlost repolarizace.

Provedení pokusů

Úloha 1

Určete prahovou intenzitu depolarizačního proudu pro vyvolání typického fyziologického akčního potenciálu při délce trváni podnětu 10 ms. Jak se mění akční potenciál při zvýšení amplitudy stimulu o 2 nA?

Úloha 2

Při amplitudě podnětu 10 nA změňte délku jeho trvání na 0.5 ms resp. na 10 ms.

Vysvětlete změny akčního potenciálu, vysvětlete jev, který budete pozorovat při velmi dlouhé stimulaci.

Úloha 3

Při stimulaci amplitudou 10 nA a trvání stimulu 1 ms měňte koncentraci draslíku v perfuzátu (3 až 10 mM/l). Popište změny klidového membránového potenciálu.

Pozorujte průběh akčního potenciálu při stimulaci podnětem o intenzitě 10 nA a délce trváni 1 ms. Vysvětlete závislost mezi extracelulární koncentrací draslíku a prahovou intenzitou stimulu.

Popište vliv blokátoru draslíkového kanálu 3,4-diaminopyridinu, který aplikujete do promývacího roztoku v koncentraci 1 mM/l. Vysvětlete jeho účinek na akční potenciál.

Úloha 4

Popište a vysvětlete účinek tetrodotoxinu (blokátoru sodikového kanálu). Jak velká dávka TTX je ještě účinná? Lze vliv TTX překonat zvýšením hladiny sodiku? O čem to svědčí?